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RT-PCR技术服务

反转录PCR(Reverse transcriptase PCR,RT-PCR)是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外,RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性,还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法,可满足客户不同的实验要求。
样品要求:提供的样品要新鲜并尽可能多,不推荐提供RNA样品,或者提供cDNA,并尽可能详细的提供背景资料(基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等)。

基本步骤
● 模板制备:见RNA提取技术服务。
● 引物设计
    客户提供上、下游引物,或者我公司提供免费的引物设计及合成(包括RT-PCR半定量检测中的内参引物)。
● 反转录
(1)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液,全量<15 μl。
 

 试剂名称  使用量  模板RNA  2μg  Oligo(dT)12-18 Primer(50μM)  2.5μl

(2)70℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。 
(3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。 
(4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
 

 试剂名称  使用量  上述模板RNA/引物变性溶液    5×M-MLV Buffer  5μl  dNTP Mixture(各10 mM)  1.25μl  RNase Inhibitor(40 U/μl )  25U  M-MLV(200 U/μl )  200U    RNase free dH2O  up to 25μl

42℃保温1小时。 
(5)70℃保温15分钟后冰上冷却,得到cDNA溶液。
若需要表达,参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析,接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因,产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。

 

RNA模板的制备需另收费(见RNA提取服务)以上为1个目的基因的报价。进行相对定量分析时,同一材料的多个目的基因的价格=1个目的基因价格×目的基因个数。
提供结果
完整的实验操作步骤、电泳图、定量分析结果等。

本公司可提供实验代做服务!


 

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