骨髓间充质干细胞BMSCs培养/诱导分化/成骨成脂诱导服务报价/价格

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骨髓间充质干细胞BMSCs培养/诱导分化/成骨成脂诱导



骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养

实验动物

4 周龄SD大鼠

主要试剂及仪器

DMEM/ F12培养基、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibico 公司,CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司。

步骤

a. 取SD大鼠,颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

b. ***酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉,PBS溶液冲洗两遍。

c. 从中折断骨头,用2ml无菌注射器吸取PBS溶液冲出骨髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清。

d. 用含10%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12 重悬细胞,接种于无菌培养瓶,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

e. 24小时后弃去培养液,PBS冲洗 2~ 3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每2~ 3d换液1次,7~ 10d细胞生长融合,经0.25%胰酶消化,1~2传代,其后一般3d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

鉴定

胰酶消化P3代细胞,PBS洗涤2次,分别加入PE标记CD29、CD34、CD45、CD90单克隆荧光抗体,并设同型对照,室温避光孵育,应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志。

细胞形态

BMSCs原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10~14天70% ~80 %可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和***状排列。



骨髓间充质干细胞诱导分化

(1)收集细胞:在显微镜下观察培养瓶贴壁面至70%-80%融合,在超净工作台上操作,先吸除培养瓶中旧培养基,用PBS洗2~3次,50mL培养瓶加入胰酶消化液约1-3mL,按此比例进行消化,晃动使消化液铺均匀,置37度培养箱约2-5min,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3mL完全培养基后,轻轻吹打,收集细胞至离心管,1 000 rpm离心5 min弃上清,加培养液,轻轻吹打成细胞悬液。

(2)细胞接种:将上述细胞悬液接种于无菌的6孔细胞培养板,加入2mL完全培养基,放入CO2培养箱 37℃培养 。

(3)细胞诱导:待细胞至50%-60%融合时,加入含50ug/lVEGF、10ug/lFGF、10%FBS的诱导培养液,放入CO2培养箱 37℃培养,连续诱导培养21d,每隔2天换液,每周传代1次。

血管形成实验

(1) 将Matrigel放于4℃融化(不能放于室温,凝固之 后不可以再用)。灭菌的100μL枪头,24孔板冷藏备用;

(2) 开始实验时,从冰箱中取出冷藏的枪头和24孔板,在24孔板每个孔中加入150μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置,Matrigel一直保持放在冰上;

(3) 加入胶后,将整个培养板放入培养箱中,放置30min使凝胶凝固;

(4) 取经不同浓度药物A处理的不同代次的主动脉内皮细胞,消化后用无血清的培养基调整细胞浓度到2×105 cell/mL;

(5) 从培养箱中取出24孔板,每孔加入200μL细胞悬液;

(6) 盖上盖子后放入培养箱培养;

(7) 24h内记录细胞变化。


人间充质干细胞hMSC成骨诱导

待细胞长至基本融合后,制备完成的成骨诱导培养液(基础培养液+0.1μmol/L***+ 50μg/mL抗坏血酸+ 10 mmol/L β - 甘油***酸钠),每隔一天换液一次,诱导21天后再进行矿化结节的茜素红染色。

茜素红染色: 

1、诱导后细胞爬片用PBS漂洗2x2min;

2、4%多聚甲醛处理(室温)20min;

3、PBS漂洗,3x2min;

4、茜素红染液染30min;

5、双蒸水冲洗2次;

6、干燥,封片。


3T3-L1脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞

3T3-L1细胞融合至约70%时,用0.25%胰蛋白酶消化,传代至6孔培养板中,待细胞接触抑制2d后(诱导分化第0d) ,用经典***鸡尾酒诱导方案诱导前脂肪细胞分化,加入分化诱导培养基1(0.5 mmol/L IBMX,1 μmol/L DEX、10ug/mL INS),72h后撤去IBMX和DEX,完全培养基中仅含有INS(诱导培养2),继续培养3d后,仅含有10% FBS,2d换液1次,诱导分化8~10d。

注意事项:

1) 待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。太早,细胞没有退出生长周期。太迟,细胞诱导后容易漂浮。 

2) 3T3细胞株20代以后分化困难,最好挑选5代左右开始诱导分化。将细胞冻存起来,使用时再复苏。 

3) 大约需要8~10天,可以诱导分化成功。之后换液处理需要轻缓,以免损失细胞。

细胞细胞形态学观察

倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内含有大量的脂滴。

威斯腾生物服务流程



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