有了这三项技术,90%以上的『基因过表达』可以实现

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基因过表达(overexpression,OE)以及敲降(KO、KD)是研究基因功能的常用技术,敲降的手段多种多样,如化学合成siRNA、载体构建shRNA、针对基因组KO的cas9、针对RNA的CRISPRi等。但OE的手段很少,大部分科研工作者只了解构建外源过表达、CRISPR-SAM两种,那么还有没有其他新颖的方式呢?

还真有!答案就是saRNA(small activating RNA),saRNA是由21个核苷酸组成的小分子非编码RNA,其结构和化学成分与siRNA相同,但作用机制完全相反,是通过靶向基因启动子区域,引发染色质构象的改变或者改变组蛋白及DNA甲基化修饰水平,从而引发转录激活作用1。saRNA的分子机制saRNA机制在机体中是广泛存在的,细胞主要依靠miRNA、piRNA实现激活途径,如mir-373靶向E-cadherin和CSDC2启动子的激活2、果蝇中piRNA触发的转录活性3。国内科研工作者早前以p21-saRNA向肿瘤细胞递送p21-saRNA评估抗肿瘤能力4(p21基因下调是结直肠癌的标志之一),为后续治疗结直肠癌提供选项,效果如何呢?作者以p21-saRNA-322(322对应启动子区域的相对位置,图2)递送三种大肠癌细胞(HCT-116,HCT-116(p53 – / –)和HT-29),通过QPCR以及WB检测了p21基因的表达(图3),结果显示,saRNA-322于72h显著提升了p21的表达水平。p21-saRNA-322靶点设计示意图p21-saRNA-322上调大肠癌细胞p21基因的QCPR,WB实验后续,作者以流式分析确认了p21-saRNA-322大肠癌细胞在G 0 / G 1期细胞发生周期停滞(数据见原文),并同时在动物水平,验证了p21-saRNA-322对于肿瘤发生的抑制性:裸鼠成瘤及瘤体检测(持续五周的裸鼠实验数据,每3天瘤内注射a组PBS,b组Scramble RNA,c组p21-saRNA-322;(A)裸鼠成瘤;(B)肿瘤提取;(C)对肿瘤的重量、体积测量;(E)肿瘤切片p21染色)由此可见,p21-saRNA-322在三种大肠癌细胞都实现了p21基因的上调,并在细胞与动物水平实现了表型的改变。需要指出的是,同个saRNA在不同细胞系,促进水平是有差异性的。在PC-3,HeLa和MCF-7细胞中,与saCON相比,p21-saRNA-322对RNA诱导分别为12.5倍,10.1倍和2.4倍。p21-saRNA-322对三种细胞的表达提升水平p21-saRNA-322在多种细胞实现靶基因的上调在E-cadherin基因上得到了重现5,显示出saRNA机制在细胞是普遍存在的,这为进一步的基因治疗开发提供了可能性。关键蛋白表达的下降通常是许多疾病的主要原因,恢复细胞中这些蛋白表达的新技术有待开发。目前主要手段有mRNA、Crispr激活、反义寡核苷酸和saRNA。但是无法合成长片段的mRNA、Crispr受困于脱靶效应及递送方式,T7体外转录的RNA可能产生异常的副产物,这些都限制了向基因治疗方向的运用。而saRNA由于其序列较短、生产成本低且可控等因素,有进一步开发为药物的优势,当然也需要克服免疫原性、脱靶性,以及合适的递送方式(纳米递送、脂质体、外泌体等)这些问题6。目前处于开发中的saRNA如下:开发中的saRNA对于科研人员,saRNA提供了除过表达、CRISPR-SAM两种常用技术之外的第三种思路,尤其是针对大基因无法构建包装的情形。saRNA可借助载体构建的策略,稳定构建于质粒及病毒载体中,以实现直接化学合成无法达到的长期高效地表达,且周期短、成本低。当然,saRNA也有其弊端,如需要筛靶、只能激活细胞本底表型,无法表达突变型等。三种OE方式对比不同的OE表达方式适合不同情形的实验,虽然各有优劣,但saRNA对于单基因下调引发的疾病治疗具有广阔的开发前景,吉凯基因可提供saRNA的一站式靶点设计、载体构建、病毒包装的服务,并长期注重于转化医学的新技术及工具开发、推广,还在等什么,感兴趣的快来咨询吧!!!欢迎扫码垂询⬆️【参考文献】1. Developing small activating RNA as a therapeutic: current challenges and promises2. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences3. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi-associated piRNA in Drosophila melanogaster4. Specific up-regulation of p21 by a small active RNA sequence suppresses human colorectal cancer growth5. Small dsRNAs indu

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