Warning!!!污染逼近,细胞之旅遭遇危机

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上次接到细胞冒险邀请函的你玩得尽兴吗?“细胞旅程”带来的绝妙观感是不是让你意犹未尽?赛默飞细胞治疗整体解决方案的横空出世, 想必也让你对中国细胞治疗的未来充满信心吧!2020年,中国细胞治疗向正式商业化又迈出了一大步,但在非密闭生产环境中,细胞污染一直存在潜在风险。无论是生物制药企业,还是生物专业学生,如何在开放式细胞培养中尽可能避免污染,都是他们亟待解决的难点。

什么是细胞污染

凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染,在非完全密闭培养条件下,细胞污染不能完全被消除,但能减少其发生的频率和后果的严重性。按照因素分类,可将污染来源分为物理污染、化学污染、生物污染三大类。

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其中物理和化学污染,可以通过强化日常操作管理,基本避免。微生物污染和样本间的交叉污染是日常避免污染的重点和难点。

接下来,我们按照一般细胞操作过程,来看看有哪些细节可以尽量避免细胞污染。

一、细胞复苏冻存 

细胞的培养操作一般是从液氮中取出冻存细胞并复苏开始。细胞长期存储在液氮罐中,不同的存储复苏条件会带来不同的污染风险。

液氮罐形式

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一般细胞冻存都是采用冻存管,但是日常操作中并不能保证冻存管100%完全密封,所以存储在液相液氮可能渗透到冻存管内,造成交叉污染或复苏时的炸管风险。一般来说液氮的气相储存优于液相储存,因为气相能够将温度维持在玻璃化温度以下(-136℃),又避免了交叉污染和炸管风险。

冻存管形式

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目前市面上冻存管一般分为外旋管和内旋管。内旋管中一般有密封圈,在气相液氮存储中密封性更好。不论外旋盖还是内旋盖冻存管,无论哪个品牌的冻存管,建议都不要直接存放在液相液氮之中!如果一定要放在液相中,建议在冻存管外加管套,防止液氮渗透进冻存管。

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复苏条件

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水浴锅是常用细胞复苏的设备,同时也是微生物滋生的温床。有些人会往水浴锅里加一些抑菌剂,但对水浴锅也会带来一定的腐蚀。水浴锅一定要经常清洗。在要求严格的洁净区内,是不允许水浴锅这种外暴露水的设备,这时金属浴等一些温控设备能避免水中微生物带来污染的问题。

 二、洁净环境

洁净环境是一个细胞实验室基础条件。新版GMP附录中,新增的《GMP附录-细胞治疗产品》部分,就对细胞治疗中不同环节的洁净度做了规定:

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GMP要求在非完全密闭的条件下,细胞操作要在B+A洁净条件下操作。

无论严格的GMP等级细胞房或是高校科研等细胞房,大部分的非密闭操作都在生物安全柜中完成。按照市面上生物安全柜的分类,绝大部分细胞操作都可在A2型生物安全柜中操作。

生物安全柜之所以可以提供洁净环境,主要靠的是柜体和HEPA滤膜形成物理屏障+稳定的平衡气流屏障。所以任何有潜在破坏HEPA滤膜和气流平衡的操作,都有可能导致细胞污染。

日常操作应该避免这些行为,防止破坏气流平衡:

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 安全柜的放置应该远离门、风扇、空调等 气流点

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禁止在生物安全柜内使用酒精灯等明火。(上升的热气流会破坏气流平衡)

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前进气格栅不能被手臂、纸、仪器设备或者其他物品阻挡

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尽量减少操作者身后的人员活动

为了防止污染,生物安全柜还要定期维护清洗,应注意:

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建议采用70%的酒精擦拭安全柜内壁和工作台面进行消毒

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柜体内应设置分区,污染区物质不离开污染区

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如果使用漂白剂进行灭菌,一定要用无菌水彻底冲洗以去除残留物

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需要年度检测已确保柜体安全等级

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如使用紫外灯,请注意紫外灯使用寿命

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柜体内尽量不要使用振荡器或离心机等非静态设备

(安全柜清洗示意)

三、离心移液操作

细胞日常培养操作中,离心和移液是最多的操作之一,也是发生污染的常见环节。

离心

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细胞样本在离心操作时,若试管盖未盖紧或无试管盖,在放入或取出时不慎,以及放置不平衡、试管破损等都会造成样本溢出导致细胞和离心机被污染。离心机在高速运转过程中也会产生气溶胶,不仅对人体的呼吸系统、消化系统、神经系统等损害很大,而且有可能造成不同细胞样本间的交叉污染。使用带密封盖的转子,可防止气溶胶的交叉污染,高速离心操作时最好佩戴口罩,做好人员防护。

移液

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移液枪在使用时也是一个潜在的交叉污染源。频繁的吸吹除了有可能会让肉眼可见的液体穿过吸头吸入移液枪内外,最主要的风险是,部分液体可能会在移液器吸吹力的作用下分散成小液滴,弥漫在移液器和吸头连接的空气柱中形成具有污染风险的气溶胶,产生交叉污染。带滤芯吸头可有效避免移液操作中的液体和气溶胶产生的交叉污染。

在一些操作过程中,需要移液枪插入容器底部,这时用加长的吸头可避免移液枪和容器内壁不小心的接触,减少污染风险。

四、培养 

细胞培养过程中,非完全密闭条件下用的最多的设备就是CO2培养箱。

开关门操作带来的污染风险

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CO2培养箱最大的风险就是开关门时内外气体的交互导致箱内气体洁净度受到影响,出现污染风险。培养箱的两个门开关取放物要迅速,否则不仅会影响CO2的浓度、温度和湿度,而且容易造成污染。切记开门时不要对着培养箱说话,大口呼吸甚至是打喷嚏。保证箱内气体的洁净度是基础。为了防止开关门带来的污染,赛默飞CO2培养箱可通过内部气体循环,加上HEPA过滤器,使箱内气体在开关门操作后短时间内达到洁净等级要求(ISO 100),避免污染发生。

培养箱内的水带来的污染风险

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培养箱内需要保持一定的湿度以供细胞生长,一般都是通过不同加湿形式达到湿度要求。传统的培养箱一般采用开放式底部水盘的形式,这种形式污染风险大,目前有更好的加湿方法,例如箱内封闭水库或箱外水库等方式。

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不管水箱形式如何,加什么样的水也是有讲究的。使用错误类型的水会损害培养箱,它可能腐蚀不锈钢,铜,玻璃或其他组件,造成污染风险。这不是因为培养箱中使用的材料的质量问题,而是水的相对纯度品质。我们越来越多地看到,在实验室中去离子水(DI),反渗透水(RO)或一级超纯水广泛用在特殊仪器。但随着时间的推移,低离子强度的高纯度水对金属和玻璃是非常有害的。接近或等于18.2MΩ-cm 的电阻率的水含有非常少量的离子。这种高纯度的水将有效地从具有高离子含量的培养箱组件中抢走离子,从而导致这些材料的腐蚀。

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为了确保您的细胞处于最佳的生长条件,延长CO2培养箱的寿命,减少污染,建议只用新鲜的无菌蒸馏水,低电阻率和pH 值7-9。同样在使用开放式底部水盘时,经常会向水盘里加硫酸铜达到抑菌目的,这同样会对不锈钢水盘造成一定的腐蚀。

培养箱内部材质

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铜—目前世界上最有效的接触表面抑菌材料,已经在CO2培养箱上得到了应用。

100%的纯铜的抗菌能力强,能迅速和有效地消除微生物污染。低铜含量的合金和镀铜不锈钢效果较差。(如下图)

随着时间的推移,100%纯铜表面氧化,其污点逐渐明显,抗菌效率随之提高。下图的研究表明,随着时间推移,铜产生变色反应,铜离子的量随之增加,其可攻击微生物污染物。

Thermo Scientific 的部分CO2培养箱具有100%的纯铜,提供防止表面污染的最佳解决方案。

日常维护

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日常清洁消毒,清洗试剂70%酒精。谨慎使用腐蚀性消毒液,若一定要使用,请在使用后用纯水再次擦拭,防止消毒水腐蚀不锈钢。此外可选用自带经第三方验证灭菌程序的CO2培养箱,保障灭菌效果。

蜂巢式培养箱

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可配置最多六个可高温灭菌的聚碳酸酯Cell Locker™ 细胞培养室系统,形成独立培养箱空间,独立管理每种细胞类型,防止交叉污染。每个Cell Locker™配备了可更换的0.2 μm 过滤膜,形成有效屏障。

五、人员防护

众所周知,人是最大的污染源,没有之一。要降低污染风险,首当其冲的对象就是人。在严格的洁净环境中,人员的安全防护控制主要是通过严格合理的更衣流程和可靠的防护服装。

传统的重复清洗洁净服,在清洗后通常会进行汉姆克滚筒或体箱试验,来表明洁净服本身无菌或是否掉纤,但却没有明确指标证明是否可以阻隔人体的微生物穿透洁净服。细菌阻隔效率Bacterial Filtration Efficiency (BFE)测试可以反映这个参数。有数据表明,重复清洗后的洁净服虽然滚筒试验等检测合格,但BFE大大降低,并不能很好的阻挡人体的微生物透到环境中,存在污染风险。所以在严格的洁净环境中,开放的细胞操作建议操作人员严格穿戴一次性防护服,减少污染的发生。

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