Nature | 炎症性肠病肠道微生物群的多重组学研究

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炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)影响着全世界超过350万人,其发病率逐年增加。IBD最常见的形式是克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),在临床、免疫学、分子、遗传和微生物水平上具有异质性,其特征是CD或UC的炎症减弱、慢性复发、虚弱、胃肠道或者结肠炎症缓解。它是由宿主、微生物和环境因素之间复杂相互作用的结果。IBD患者肠道微生物群的常见变化是兼性厌氧菌(如大肠杆菌)增加,产生短链脂肪酸(SCFAs)的专性厌氧菌减少。哈佛大学Curtis Huttenhower研究团队建立Inflammatory Bowel Disease Multi’omics Database(IBDMDB),作为整合人类微生物组项目的一部分,以强化对IBD肠道微生物组病因学的系统理解,相关研究成果发表于《Nature》。

本研究从五个学术医疗中心(三个儿科队列和两个成人队列,Fig.1a)招募了132名参与者并随访1年,根据初始内窥镜和组织病理学结果未诊断为IBD的个体被归为非IBD对照组(Non-IBD),共收集24个时间点的651例活检,529例血样和1785例粪便样本进行宏基因组(MGX),元转录组(MTX),蛋白质组(MPX),代谢组(MBX)和病毒体(VX)检测(Fig.1b),得到305个样本的全部测量分析数据结果及791个MGX- MTX结果(Fig.1c)。

IBD肠道微生物群的多组学变化

主坐标分析显示第二主坐标轴更能区分IBD,特别是CD,且大多数变异是由拟杆菌门和厚壁菌门之间的权衡引起的,IBD个体的α多样性低于Non-IBD(图1d)。大多数测试数据在受试者间、受试者内横断面和纵向上存在相关性,从MGX,MTX和MPX中获得的功能谱是联系最紧密的(图1e),IBD和Non-IBD患者间的横断面差异在代谢组中最为明显(图1f, 2a)。这可能是由于营养吸收不良、肠内水分或血液含量增加以及IBD个体肠内转运时间缩短造成的。IBD患者的多不饱和脂肪酸(肾上腺素和花生四烯酸)更为丰富,而IBD患者肠道中泛酸盐和烟酸盐(分别为维生素B5和B3)缺乏,而烟酸盐在肠道中具有抗炎和抗凋亡的功能,此外,IBD患者血清很少存在B族维生素缺乏症状。

粪便钙卫蛋白和Harvey Bradshaw指数(HBI)是CD疾病严重程度的两个指标,UC中的简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)与粪便钙卫蛋白水平相关性较弱(图2b)。微生物失调评分通常作为疾病活动的衡量指标,通过测量血清ASCA(抗酿酒酵母抗体)、ANCA(抗中性粒细胞胞质抗体)、OmpC(外膜蛋白C)和CBir1(抗鞭毛蛋白)抗体滴度的高低来评判。在生态失调期间的分类学扰动同样反映了在IBD横断面观察到的现象,如CD中的专性厌氧菌(Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia hominis)的消耗以及大肠杆菌等兼性厌氧菌的富集(图2f)。IBD中比较突出的两种瘤胃球菌Ruminococcus torques, Ruminococcus gnavus在失调的CD和UC中的含量也存在显著差异。

在代谢组中,SCFAs通常在生态失调组中减少,丁酸盐的减少与丁酸盐产生菌如F. prausnitzii和R. hominis的消耗相一致(图2f)。CD生态失调组中初级胆酸盐、甘氨酸/牛磺酸结合型胆汁酸、甘氨鹅脱氧胆酸出现富集;次级胆汁酸石胆酸盐和脱氧胆酸盐的减少,表明产生次级胆汁酸的细菌在IBD生态失调中被耗尽或者通过结肠的转运时间太短,这些化合物不能代谢。此外许多酰基肉碱在生态失调中显著富集,而基础代谢物的水平通常会降低(图2f)。然而花生四烯酰肉碱(C20:4肉毒碱)减少,游离花生四烯酸(参与炎症的前列腺素的前体)增加(图2a)。与胆汁酸一样,肉毒碱也是微生物修饰的化合物,如左旋肉碱往往具有抗炎作用,而脂肪酸结合的肉毒碱对肠道炎症不起作用。在失调的IBD个体中,许多其他代谢物也显著改变(检测到的548种代谢物中有117种具有显著差异),代谢产物池的大规模失调与宿主和微生物的分类学和分子特征相一致(图2f),微生物生态失调期间的显著代谢组学差异与疾病期间预期的变化一致,进一步表明生态失调与IBD相关。

肠内微生物群稳定性下降

IBD中微生物群的时间变化更频繁,通过宏基因组学、宏转录组学和代谢组学谱分析,每个受试者的微生物组随时间偏离基线(Fia.3a)。作者通过寻找连续时间点之间微生物群的‘shifts’(Bray Curtis差异,用于描述不同个体的差异而非个体内部差异)来表征大规模的时间差异(图3a)。首先,仅考虑宏基因组分类学特征,发现166个‘shifts’(Non-IBD, 39; UC, 44; CD, 83),CD或UC患者的转换率略高于Non-IBD(2.09,1.83,1.79/年)。相对丰度变化最大的物种差异显著(图3b),Non-IBD个体的移位主要发生在丰度高的普氏菌属(Prevotella copri)个体中,其在数周至数月丰度反复波动,IBD患者的相对丰度更稳定(图3c)。IBD的分类学变化反映了早期观察到的专性厌氧菌的相对减少和兼性厌氧菌的过度生长(图3b),并与进入和退出生态失调相对应,如大肠杆菌促成了IBD的大量转移。

代谢组学的转换率大约是宏基因组的一半(Non-IBD, 1.05; UC, 0.99; CD, 1.36),检测了相同受试者相邻样本之间代谢物谱的差异,并通过诊断发现了显著的分离(图3d)。尿胆素在Non-IBD的个体中具有最大差异,CD患者中差异大的尿酸盐,及m/z 152.0354且RT为4.16 min的feature(可能吡啶醛的甲酸加合物)很大程度上与UC有关。其中甲咪唑乙酸和尿酸盐是最主要的转移因子(图3 e),当然未知代谢物是导致差异的主要原因,需要进一步的开展代谢物注释来确定未知代谢物在IBD中的重要性,如HILp_QI22918, m/z值为648.43067, RT为5.03 min的feature在IBD患者中贡献最为显著。

微生物相关的宿主因子

作者将基线时结肠镜下的肠道活检结果纳入IBD中微生物组的分析,对每个活检取样部位进行单独的微生物组和表型关联分析。相比Non-IBD,在CD回肠炎症部位鉴定了305个基因,其中IL-17信号富集最强;CD和UC直肠炎症部位鉴定了920个存在显著差异表达的基因(DEGs)(Fig.4a),包括可直接影响共生微生物的基因如抗菌CXCL6(细胞膜破坏因子),SAA2(抑制革兰氏阴性菌的生长)及间接微生物调节剂如DUOX2(双氧酶,产生活性氧),LCN2(通过隔离诱导微生物铁饥饿)(图4b)。为了确定微生物组中与这些变化最相关的成分,相同的样本进行16S测序,分别在回肠和直肠中鉴定出31和106对显著的OTU对,Spearman相关性分析显示DUOX2及其成熟因子DUOXA2均与回肠中瘤胃球菌科UCG 005 (OTU 89)的丰度呈负相关。几种趋化因子基因的表达显示抗菌剂(CXCL6, CCL20)与直肠中的短杆菌 (OTU 120)、链球菌(OTU 37) 和Eikenella (OTU 39) 的相对丰度呈负相关,表明这些物种对上述趋化因子的活性最敏感。

动态的多元微生物相互作用

接下来作者采用宏基因组物种、物种水平转录率、酶基因家族(MGX, MTX, MPX)功能谱、代谢物、宿主转录(直肠和回肠),血清学和粪便钙卫蛋白的数据构建关联网络来搜索可能构成IBD疾病活动的宿主和微生物分子相互作用。为了确定与炎症和疾病状态密切相关的共变异,首先使用混合效应模型对每种测量类型进行残差分析确定差异丰度,得到53161条边和2916个节点,再构建过滤子网对每个测量类型的前300条边(按P值)进行可视化,其中至少一个连接节点与生态失调相关(图4c)。具有至少20个连接的节点作为该网络的中心(Hubs),认为在生态失调中差异丰富。F. prausnitzii是关联最强的分类学特征,还有未被分类的Subdoligranulum,均与胆固醇和肌苷的丰度相关,许多ECs的表达在失调中被下调。

酰基肉碱和胆汁酸在网络中占据突出地位。大肠杆菌占上调ECs的大部分,Roseburia(与Subdoligranulum一起)参与IBD中肉毒碱和胆汁酸的失调。酰基肉碱与许多物种生态失调相关如人葡萄球菌(9种酰基肉碱),肺炎克雷伯氏菌(3种)和副流感嗜血杆菌(3种),C. bolteae(3种)的表达。C8肉毒碱是网络中特别值得关注的生物化学中心,另一种在失调CD中显著增加的酰基肉碱,和胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、牛磺酸脱氧胆酸盐共占了107个边缘(6%;图4c)。其他重要的代谢物关联包括几个长链脂质中枢和SCFA丙酸盐; 抗OmpC抗体与众多ECs的宏基因组丰度密切相关;钙卫蛋白与生态失调中含量差异不显著的代谢物及ECs的宏基因组丰度弱相关。在这个重要的子网络中出现了三个宿主基因(GIP,NXPE4,ANXA10)的回肠表达。RNA聚合酶的表达也是网络中的一个突出节点,在生态失调中被上调。本研究将IBD中多种类型的微生物群破坏与许多分子特征联系起来,这些分子特征将成为后续研究IBD和胃肠道炎症机制的潜在目标。

小结

本研究开发的IBDMDB是对IBD动力学中涉及的肠道微生物组的多个分子特征的首批综合研究之一。作为整合人类微生物组项目(HMP2或iHMP)的一部分,作者对132名受试者进行了为期一年的跟踪研究,以获得疾病期间宿主和微生物活动的纵向综合分子谱(各24个时间点,共2965例粪便、活检和血液标本)。在肠道炎症疾病活动期间肠道微生物功能失调,证明了兼性厌氧菌的特征性增加是以牺牲专性厌氧菌为代价,微生物转录(例如梭状芽孢杆菌)、代谢产物池(酰基肉碱、胆汁酸和短链脂肪酸)和宿主血清抗体水平的分子紊乱。在确定代谢物池的变化是宿主驱动的还是微生物驱动的之后,酰基肉碱失调也可能成为IBD治疗的潜在新靶点,疾病活动期以时间变异性的增加为特征,具有特征性的分类、功能和生化变化。最后,综合分析确定了导致这种失调的微生物、生化和宿主因素。本文提供了迄今为止最全面的炎症性肠病宿主和微生物的测量数据,最重要的是将这些分子结果带回临床,以更好地预测IBD进展和结果的生物标志物,并作为一组新的宿主微生物相互作用靶点,从而开发出治疗IBD的方法。

参考文献

Jason L P, Curtis H, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature 569, 655–662 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1237-9.

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